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文献速递 | Naica数字PCR检测细胞因子

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  这项研究旨在探究炎症细胞因子和趋化因子与朊病毒疾病的相关性,这些数据使我们对朊病


近日中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所朊病毒实验室,在Virologica Sinica杂志上发表“IP10, KC and M-CSF is Remarkably Increased in the Brains from the Various Strains of Experimental Mice Infected with Different Scrapie Agents”。该研究采用了Luminex、ELISA、IHC和RT-PCR等多种方法,发现IP10、KC和M-CSF转录及翻译水平在不同羊瘙痒症感染啮齿类动物模型大脑中其含量显著升高,且与小鼠的遗传背景无关。这项研究旨在探究炎症细胞因子和趋化因子与朊病毒疾病的相关性,这些数据使我们对朊病毒感染期间的炎症反应和朊病毒疾病的进展有了更好的了解。该杂志2020年影响因子3.242。

文献内容

朊病毒疾病

痒病由亚病毒中的朊病毒所致,是一种长期的进行性、衰竭性与致死性的神经疾病。朊病毒病(PrDs)是由聚集的感染性朊病毒蛋白(朊病毒)错误折叠引起。散发性克雅氏病(sCJD)则是人类最常见的朊病毒疾病,在人和动物的朊病毒病中观察到类似的神经病理学特征。脑内朊病毒的沉积与皮质海绵状变性、神经元丢失以及小胶质细胞和星形胶质细胞的活跃胶质增生有关,而小胶质细胞和星形胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞。胶质细胞作为先天性免疫系统的重要组成部分,其活化后产生的各种细胞因子可能参与了朊病毒病的进展。
 
在朊病毒疾病的大脑中反复出现炎症细胞因子和趋化因子的异常升高,其中包括促炎性细胞因子IL1a、 IL1b 、TNF、IL6 以及抗炎细胞因子TGFb、IL4 和IL10 等。研究发现,在感染痒病菌株22L的小鼠中IP10和KC发生上调。IP10作为一种趋化因子,与受体CXCR3结合并激活多种信号通路,导致炎症因子流入感染或炎症组织。在朊病毒感染过程中,IP10介导的信号通路被激活,包括Erk1/2和JNK通路。与IP10一样,KC也属于趋化因子CXC家族,与炎症、血管生成、肿瘤发生广泛相关,并参与神经退行性疾病的进展。在中枢神经系统中,M-CSF由星形胶质细胞合成,但鲜有研究报道M-CSF在朊病毒发病机制中的变化情况。

实验室介绍

朊病毒病室实验室隶属于病毒病预防控制所,病毒病预防控制所是中国疾病预防控制中心下属的独立法人机构。其前身为1949年成立的中央卫生研究院病毒系,后于1964年成立中国预防医学科学院病毒学研究所,原隶属于中国医学科学院。1983年,病毒学研究所划归中国预防医学科学院。2002年1月23日,病毒学研究所正式更名为中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,简称病毒病所。

朊病毒病室实验室的主要研究方向:拟订朊病毒病预防控制相关的规章规范、标准、技术指南及方案预案等提供科学依据;应对人类及动物朊病毒病疫情和突发公共卫生事件提供技术支持,参与和指导地方相关疫情和突发公共卫生事件的调查和处置;组织开展全国人类朊病毒病监测工作,收集、分析、解释、报告和反馈监测数据,评价和改进监测系统;协调与国家疯牛病监控网络工作;开展监测、检测技术研究和技术贮备,为各级疾控机构的朊病毒病预防控制工作提供技术指导;开展朊病毒病原学、流行病学、遗传学、神经生物学、个体生物学等科学研究及朊病毒病致病机理的研究,开展相应的诊断、预防和治疗等生物技术研究,开展其它中枢神经系统退行性疾病的研究;建立和完善人类朊病毒病参比实验室,开展朊病毒病相关毒种和生物样本等资源的保藏和相关生物安全研究;开展朊病毒病相关的研究生教育培养和全国疾控人员的专业技术培训,开展相关的国际合作与交流,参与朊病毒病的预防控制和研究工作;承担上级交办的其他各项工作。

摘要

在朊病毒疾病患者的中枢神经系统中,经常观察到炎症细胞的激活和一些细胞因子的上调。为了评估朊病毒感染过程中一些很少被处理的脑细胞因子的潜在变化,该研究首先通过Luminex实验筛选了感染不同痒病病株的小鼠脑中17种不同细胞因子的水平。在许多感染痒病小鼠的脑裂解液中检测到IP10、KC和M-CSF显著上调。ELISA和免疫组化实验进一步证实了这三种细胞因子在痒病感染小鼠大脑中的表达上调。qRT-PCR和数字PCR检测到感染痒病小鼠大脑中IP10、M-CSF和KC的特异性mRNA的增加。对感染后不同时间点采集的脑标本进行动态分析,发现这三种细胞因子的增加呈时间依赖性,特别是在痒病感染潜伏期的IP10。此外,还发现45例散发性克雅氏病(sCJD)患者脑脊液(CSF)中IP10的水平略高于未诊断为朊病毒病的患者。

文中对感染小鼠大脑组织中的IP10转录本的绝对数量,使用的Naica数字PCR进行检测,方法描述如下所示:

如下图所示,使用实时荧光定量PCR和数字PCR对各种瘙痒病感染的小鼠模型中IP10,KC和M-CSF的转录水平进行比较分析。

A:相对于单个β-actin的转录水平,确定了IP10,KC和M-CSF特异性mRNA的转录水平。
B:感染139A,ME7的小鼠和对照组的大脑IP10 DNA拷贝数。

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https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12250-020-00216-3

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来源:生物通